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（一） 基本原理　免疫印跡又稱(chēng)Western印跡（Western  blot），與DNA的Southern印跡技術(shù)相對應，兩種技術(shù)均把電泳分離的組分從凝膠轉移至一種固相載體（通常為NC膜），然后用探針檢測特異性組分。不同的是，Western blot所檢測的是抗原類(lèi)蛋白質(zhì)成分，所用的探針是抗體，它與附著(zhù)于固相載體的靶蛋白所呈現的抗原表位發(fā)生特異性反應。該技術(shù)結合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測定特異敏感等諸多優(yōu)點(diǎn)，具有從復雜混合物中對特定抗原進(jìn)行鑒別和定量檢測，以及從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體的*性。該技術(shù)的靈敏度能達到標準的固相放射免疫分析的水平而無(wú)需對靶蛋白進(jìn)行放射性標記。

目前，Western blot廣泛用于蛋白質(zhì)研究、基礎研究和臨床醫學(xué)的研究。

（二） 基本方法　先將待檢測樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 （PAGE）分離各組分，然后通過(guò)印跡技術(shù)把分離樣品幾乎原位、定量轉移到NC膜上。隨后進(jìn)行類(lèi)似間接ELISA法測抗原的反應，即用特異抗體與NC膜上的靶抗原反應，結合上的抗體可用與辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗免疫球蛋白進(jìn)行反應，zui后通過(guò)與酶的底物發(fā)生顯色反應來(lái)做檢測。

實(shí)際操作時(shí)，常把印跡后的NC膜分成兩部分，一部分如上所述做免疫檢測，另一部分直接進(jìn)行蛋白質(zhì)染色，以便對轉移情況做直接觀(guān)察和判斷待測抗原所處位置及推算其分子量。

操作方法具體如下：

1.樣品的制備　樣品的制備方法的選擇取決于樣品的類(lèi)型和待測抗原的性質(zhì)。細菌樣品一般直接用SDS凝膠加樣緩沖液裂解。哺乳動(dòng)物組織通?？蓹C械分散并直接溶于SDS凝膠加樣緩沖液。組織培養的單層細胞可用去污劑溫和裂解，也可直接在SDS凝膠加樣緩沖液中裂解。制備好的樣品用做SDS-PAGE分析。

2.蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析　PAGE過(guò)程有三種物理效應可使樣品分離開(kāi)來(lái)，包括樣品的濃縮效應、凝膠的分子篩效應、一般電泳的電荷效應。因此，樣品分離效果好，分辨力高。

而SDS-PAGE是將強陰子去污劑十二烷基磺酸鈉（SDS）與還原劑巰基乙醇并用，并通過(guò)加熱，使蛋白質(zhì)解離成多肽后再加樣于電泳凝膠上。由于各種SDS-多肽復合物均帶負電，且形狀近似，因此，該復合物在電場(chǎng)中的遷移率只取決于蛋白質(zhì)的大小，這樣通過(guò)SDS-PAGE可將不同大小的蛋白質(zhì)樣品分離開(kāi)來(lái)，借助已知分子量的標準參照物，可推算出相應的分子量。（三）將蛋白質(zhì)從凝膠轉移到NC膜上  操作方法如下：

（1） 剪6塊粗濾紙和一塊NC膜（大小應與凝膠一致），并在轉移緩沖液（48 mmol/L Tris.HCl，39 mmol/L甘氨酸，0.037％SDS）中浸泡3-5分鐘。

（2） 將轉移電泳槽塑料支架平放，依次置放海綿、3塊濾紙、NC膜、凝膠及另外3塊濾紙和海綿，放置過(guò)程注意驅除夾層間氣泡。用支架夾緊上述各層，置電轉移槽中，NC膜一側靠正極，凝膠一側靠負極。

（3） 接通電源，40V、約1.轉移1.5-6小時(shí)。轉移時(shí)間長(cháng)短依靶蛋白分子量大小來(lái)調節。

（4） 轉移結束，取出NC膜做好上、下端標記，切下一小條做蛋白質(zhì)染色處理，以檢查轉移效果。

（5） 將NC膜置干凈濾紙上，室溫自然干燥。

4.封閉　這一步處理的目的在于封閉NC膜上一些非特異性蛋白質(zhì)的潛在結合位點(diǎn)，以避免非特異性反應。通常是在PBS緩沖液中加入1％脫脂奶粉或牛血清白蛋白配成封閉液，并將 NC膜浸泡其中，室溫封閉1小時(shí)左右。

5.（五）免疫檢測和顯色反應　包括NC膜與*抗體、酶標抗抗體（即第二抗體）反應，以及用酶相應的底物處理進(jìn)行顯色反應。

（1） 將封閉好的NC膜浸入*抗體溶液中，抗體液依0.2ml/cm2調節用量，室溫或37℃溫和振蕩反應1-2小時(shí)。

（2） 棄去抗體液，用PBS洗滌。

（3） 將NC膜浸入酶標第二抗體反應液，用量與一抗相同，37℃或室溫輕振蕩1-2小時(shí)。

（4） 棄二抗反應液，PBS洗滌。

（5） 將膜放入相應顯色液中，觀(guān)察顯色反應。陽(yáng)性反應將在靶蛋白相對應的位置上出現有顏色的條帶，而其余位置無(wú)顯色條帶出現。

（三） 免疫印跡技術(shù)的應用實(shí)例　用免疫印跡技術(shù)可定性、定量地檢測出待檢樣品中含量很低的特定病原體的抗原成分。對于一些能感染細胞而細胞病變不易觀(guān)察的病原體的檢測也很有用。用單克隆抗體做為*抗體進(jìn)行免疫印跡，還可以對毒株做分型研究。

1990年，西班牙等一些發(fā)現有非洲豬瘟的國家已將ELISA結合Western blot技術(shù)廣泛應用于非洲豬瘟病毒（ASFV）抗體的檢測以幫助實(shí)施ASFV撲滅計劃。先用ELISA技術(shù)對大批血清樣品進(jìn)行初篩，隨后用Western blot技術(shù)對陽(yáng)性樣品進(jìn)一步做驗證，可有效排除假陽(yáng)性反應。 1995年，Alcaraz.C等應用基因工程技術(shù)成功建立了特異性更為理想的重組Western blot技術(shù)。他們用大腸桿菌系統克隆并表達了ASFV抗原性病毒結構蛋白p54，將重組p54做為抗原建立了Western blot檢測技術(shù)。原有的Western blot技術(shù)所用的抗原是通過(guò)病毒感染哺乳動(dòng)物細胞而分離獲得，不可避免有細胞雜蛋白干擾。而應用重組蛋白做為抗原，成分專(zhuān)一，可保證檢測結果的高度特異，還能避免將活毒應用于檢測試驗所可能帶來(lái)的散毒危險。