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一、原理
1。熒光染料 Hoechst 33342 能少許進(jìn)入正常細胞膜，使其染上低藍色，而凋亡細胞的膜通透性增強，因此進(jìn)入凋亡細胞中的Hoechst 33342 比正常細胞的多，熒光強度要比正常細胞中要高，此外，凋亡細胞的染色體DNA 的結構發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA 結合，并且凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342 排出到細胞外使之在細胞內積累增加等都使凋亡細胞的藍色熒光增強。

2．PI 染料是不能進(jìn)入細胞膜完整的正常細胞和凋亡細胞中，即活細胞對PI 染料拒染，而壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損，可被PI 染料染色。

3．根據這些特性，用Hoechst 33342 結合PI 染料對凋亡細胞進(jìn)行雙染色，就可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區別開(kāi)來(lái)。在雙變量流式細胞儀的散點(diǎn)圖上，這三群細胞表現分別為：正常細胞為低藍色/低紅色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡細胞為高藍色/低紅色（Hoechst33342++/PI+），壞死細胞為低藍色/高紅色（Hoechst 33342+/PI++）。
二、試劑材料
Heochst 33342 染液1.0mL
Propidium Iodide （PI）500 ul
10×PBS 10 mL
三、操作步驟
1. 懸浮生長(cháng)的細胞離心收集，固定培養的細胞消化收集后，將105~106 個(gè)細胞懸浮于1ml 培養基中，再加入10ul Heochst 33342 染液，混勻，370C 孵育5-15 min；
2. 細胞于 40C 500 ~ 1000r/min 離心5min 棄去上清液；
3. 加入1.0ml PBS 懸浮細胞，加入5 ul PI 染液，避光混勻；
4。流式細胞儀分析或熒光顯微鏡觀(guān)察：Heochst 33342 用氪激光激發(fā)的紫外光，激發(fā)波長(cháng)為352nm，發(fā)射波長(cháng)為400 ~ 500nm，產(chǎn)生藍色熒光；PI 用氬離子激光激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長(cháng)為488nm，發(fā)射光波波長(cháng)大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光。分析藍色熒光對紅色熒光的散點(diǎn)圖或地形圖。結果判斷：在藍色熒光對紅色熒光的散點(diǎn)圖上，結果為：正常細胞為低藍光/低紅光，凋亡細胞為高藍光/低紅光，壞死細胞為低藍光/高紅光。
四、注意事項
1. 在紅色熒光對藍色熒光散點(diǎn)圖上，還可見(jiàn)到細胞凋亡區向細胞壞死區遷移的軌跡，可能是凋亡細胞的DNA進(jìn)一步降解的緣故。
2. 用Heochst 33342 染料與細胞孵育的時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，一般控制在20min 之內為宜。如果太長(cháng)可引起Heochst33342 的發(fā)射光譜由藍光向紅光的遷移，導致紅色熒光與藍色熒光的比例改變，從而影響結果的判斷。
3.Propidium Iodide （PI）有毒，操作時(shí)要戴手套。